随着制药企业对生物治疗药物的日益重视,在药物研究中使用lcms定量分析蛋白和多肽药物已经引起越来越多研究者的兴趣。艾塞那肽是一种治疗性多肽,目前已被批准用于治疗i型和ii型糖尿病。艾塞那肽可增强胰腺β细胞分泌葡萄糖依赖性胰岛素,以调节糖代谢和胰岛素分泌。

近年来,血浆中艾塞那肽的浓度测定主要通过配体实验来完成,例如利用酶标免疫测定法进行艾塞那肽的 药代动力学研究。但是,由于某些具有相似理化性质的化合物的存在,致使酶标免疫测定法缺乏足够的特异 性和选择性,导致采用该方法分析将面临一定的风险。基于以上原因,采用ab sciex qtrap®5500系统的 mrm3模式确保分析血浆中多肽药物时能够达到更高的选择性。

实验方法

样品制备:提取人血浆中的艾塞那肽,用氮气吹干,复溶。在所有的操作步骤中,ph值及有机相都要严格控制。

串联质谱技术在药物高通量筛选和生物分析中的应用

液相色谱条件:uhplc采用shimadzu uflc lc-20acxr;反相色谱柱为c-18 2.0 x30mm,5μ;流速为 0.6ml/min;进样体积为5 μl;流动相a为含0.1%甲酸的水溶液,流动相b为含0.1%甲酸的甲醇溶液;梯度5分 钟,流动相b浓度从2%升至95%。

质谱条件:使用ab sciex qtrap® 5500系统中的mrm3扫描模式进行lc/ms分析。开启离子阱的动态填充时间(dft)功能,在10,000da/s的扫描速度下进行ms3扫描。总周期时间为0.17s。采用质荷比 838→396→202进行mrm3分析。qtrap® 5500系统进行mrm3分析原理展示在图2中。

图1. 艾塞那肽结构。艾塞那肽是由39个氨基酸组成的多肽(mw =4186.6 da),是糖代谢和胰岛素分泌的调节剂。

图2. mrm3定量分析工作原理。首先在q1四极杆中选择母离子,然后在q2碰撞池中碎裂,其子离子在线性离子阱中富集并分离,接着通过激发产生第二级碎片,然后将第二级产物离子扫描至检测器。

实验结果

在增强全扫描模式(ems)下,选择多电荷母离子[m+5h]5+838.3作为前体离子(母离子,图3,上左 图)。当前体离子碎裂后,选择m/z 396.4为*级子离子(增强子离子扫描(epi),图3,上右图)。* 级子离子m/z 396.4在阱内进一步碎裂产生ms3质谱(图3,下图),选择其中主要的碎片离子m/z 202.2作为 ms3定量的第二级子离子。

艾塞那肽检测结果

使用mrm3方法后,显著提高了人血浆中艾塞那肽分析方法的选择性。图4展示出了mrm3方法与传统的 mrm定量方法所得结果的对比,mrm3方法结果中基线更低,完全消除了血浆中的内源性干扰。qtrap® 5500 快速的扫描速度(10,000da/s)可使分析物的色谱峰有足够的采集点,从而使定量结果具有很好的重现性。

如表1中所示,mrm3方法显著改善lloq及qc的分析结果,6次连续进样分析的准确度及cv%证明: mrm3方法具有很好的定量性能,完全适用于生物分析。

图3. mrm3实验设计。 ems扫描(上左图)后选择丰度高的母离子,然后使用epi扫描以识别出*强的碎片离子(上右图),*后采用ms3扫描选择*佳第二级碎片进行提取。

图4. mrm3检测方法显著提高血浆中化合物检测的选择性。 进行血浆中艾塞那肽检测时,mrm3模式可通过消除色谱干扰、降低背景噪音来改善loq。

结论

更好的线性(r2=0.996)。

表1:mrm3方法检测的准确度和重现性。质量控制样品的重复性结果表明:mrm3分析与验证的生物分析相一致。

串联质谱技术在药物高通量筛选和生物分析中的应用

图5. 使用mrm和mrm3方法检测人血浆中艾塞那肽的标准曲线。 mrm3(右图)的线性范围是5-1000ng/ml,相对mrm(左图)的250-1000ng/ml,mrm3方法明显具有

1. mrm3分析方法可以成功应用于人血浆中艾塞那肽生物分析。

2. mrm3分析能够提高生物分析方法的选择性,消除基线噪音及色谱干扰,与传统的艾塞那肽mrm分析结果相比体现了卓越的分析性能。

3. mrm3分析结果显示其可获得从5-2000ng/ml浓度范围内优异的标准线性。相比较,传统的mrm方法的

线性浓度范围为250-1000ng/ml。

4. mrm3方法检测的准确度和重现性完全符合生物分析实验的要求。

参考文献:

1. mrm3 quantitation for highest selectivity in complex matrices. ab sciex technical note, publication 0920210-01.

多肽药物

http://www.absciex.com.cn/applications/drug-discovery-and-development-mass-spec/biopharma-in-china

液相色谱

http://www.absciex.com.cn/products/hplc-products

lcms

http://www.absciex.com.cn/products/mass-spectrometers/qtrap-systems/ab-sciex-qtrap-6500-lcmsms-system